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        Molecular Cell:研究揭示MLL家族蛋白具有不同產物特異性的分子機制

          賴氨酸甲基轉移酶催化底物發生甲基化是一類經典的多步催化反應,賴氨酸可以被加上一個、兩個、或三個甲基。同一位點不同程度的甲基化狀態一般被視為不同的化學修飾標記,發揮著不同的生物學功能。其中最典型的例子是組蛋白H3K4的單、雙、三甲基化。在哺乳動物體內,H3K4的三甲基化(H3K4me3)通常分布在轉錄起始位點(TSS)附近,和轉錄激活息息相關;H3K4的單甲基化(H3K4me1)則通常位于增強子區域,作為增強子的典型標記。

          H3K4不同程度的甲基化為何有不同的基因組分布?一般認為和甲基轉移酶的基因組定位和它們催化不同甲基化產物生成的酶活特性(產物特異性)密切相關。H3K4甲基化在體內主要是由MLL家族甲基轉移酶催化的。在哺乳動物中,有6個具有甲基轉移酶活性的MLL家族蛋白成員,包括MLL1,MLL2,MLL3,MLL4,SET1A和SET1B。盡管都源于酵母中相同的祖先Set1,但不同的MLL家族蛋白在細胞命運決定中發揮著重要且非冗余的功能。過去大量體內外研究表明不同的MLL家族成員具有不同的產物特異性,即生成單、雙、三甲基化產物的能力不同,但如何準確界定不同MLL蛋白的產物特異性,仍缺乏一個可靠的判斷標準。

          早在2003年,就有研究者提出了“F/Y switch”模型用以解釋甲基轉移酶的產物特異性。該模型認為,SET催化結構域活性口袋的一個關鍵氨基酸殘基,決定了甲基轉移酶的產物特異性。具有酪氨酸(Y)殘基的甲基轉移酶,一般只能催化單甲基化,而具有苯丙氨酸(F)殘基的甲基轉移酶,可以催化雙甲基化或者三甲基化。但目前的“F/Y switch”規則仍無法區分二甲基和三甲基轉移酶,并且無法解釋MLL家族不同的產物特異性。MLL家族蛋白的活性口袋具有完全一致的F/Y switch殘基,卻呈現了不同的產物特異性,其背后的分子機制一直是領域內懸而未決的問題。

          中科院分子細胞科學卓越創新中心的陳勇團隊、華東理工大學的全舒團隊、大連化學物理研究所的李國輝團隊、國家蛋白質科學中心(上海)的劉志軍、彭超合作,在 Molecular Cell 期刊發表了題為:Structural basis for product specificities of MLL family methyltransferases 的研究論文,揭示了MLL家族成員具有不同產物特異性的結構基礎和分子機制。

          

          在該研究中,研究團隊系統地比較了MLL家族復合物的產物特異性。他們發現,所有的MLL復合物都可以在短時間內單甲基化未修飾的H3。大部分MLL復合物可以繼續把單甲基化的H3進一步甲基化生成二甲基化產物,隨著時間的延長,MLL1,MLL2,SET1A,SET1B復合物則可以更進一步產生三甲基化的產物。這些現象說明,單從某個具體的時間節點檢測單、雙、三甲基化產物的生成來定義甲基轉移酶的產物特異性是不準確的,所觀察到的產物生成情況與酶濃度、酶的活性、產物特異性等多種因素相關,因此需要綜合考慮各級甲基化的反應速率來定義MLL的產物特異性。

          進一步,研究團隊建立了Methyl-Quant WB,Methyl-Quant LC–MS/MS和Methyl-Quant MALDI-TOF MS三種定量方法,用來表征MLL復合物催化單、雙、三甲基化反應的動力學差異。通過測定不同MLL復合物催化底物發生單、雙、三甲基化的速率常數k1,k2,k3及比較各級反應速率之間的差距,研究人員將MLL1/MLL2定義為非連續的二甲基轉移酶,MLL3/MLL4定義為單甲基轉移酶,而SET1A/SET1B是非連續的三甲基轉移酶。利用這些測活系統,研究人員進一步發現產物特異性主要由最小的MLL-RBBP5-ASH2L三元復合物決定,其他的亞基如DPY30等主要影響酶活速率而不影響產物特異性。

          為了進一步探討產物特異性的分子機制,研究人員綜合利用X-射線晶體學,19F-NMR和分子動力學計算模擬表征了MLL家族蛋白活性口袋兩個F/Y switch關鍵酪氨酸殘基的空間構象和動態性。他們發現,不同MLL家族蛋白中的關鍵酪氨酸殘基的構象基本一致,但是卻表現出了不一樣的動態性。對于第一個關鍵酪氨酸殘基(Y1),動態性SET1B>MLL1>MLL3,所以SET1B和MLL1可以克服Y1的空間位阻,利于發生H3K4me1到H3K4me2的過程,而MLL3中的Y1相對固定不利于二甲基化反應的進行。對于第二個關鍵酪氨酸殘基(Y2),動態性SET1B>MLL1,所以SET1B更容易克服Y2的空間位阻,利于催化產生H3K4me3。這一分子機制也可以推廣到其它的甲基轉移酶,比如F/Y switch的動態性可以用于區分二甲基轉移酶GLP和三甲基轉移酶DIM5。

          綜上所述,這項工作提出,在級聯反應中,不同步驟之間的速率比(k1/k2和k2/k3),而不是絕對反應速率,是定義組蛋白甲基轉移酶產物特異性的定量標準。這項工作揭示了關鍵氨基酸的動態性在甲基轉移酶催化進程中的重要作用,為進一步了解組蛋白甲基化的動態調控機制奠定了基礎。根據這個工作,人們將來可以通過點突變改變組蛋白甲基轉移酶的產物特異性,用以闡明不同狀態的甲基化修飾在各種生命活動中的重要功能。

          

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